병렬 마이크로규모 단백질 라벨링 및 평균 라벨링 정도(aDoL)에 대한 정밀한 제어 방법

Mar 22, 2023

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 8961(2023) 이 기사 인용

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단백질 결합을 위해 널리 사용되는 접근 방식은 라이신 잔기가 NHS 또는 기타 활성 에스테르와 반응하는 것입니다. 그러나 활성 에스테르의 불안정성과 반응 효율의 가변성으로 인해 라벨링 정도(DoL)를 정확하게 제어하는 ​​것이 어렵습니다. 여기에서는 기존 무동 클릭 화학 시약을 사용하여 aDoL을 더 효과적으로 제어하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 이는 중간에 한 번의 정제가 포함된 2단계 반응입니다. 간단히 말해서, 관심 있는 단백질은 먼저 azide-NHS로 활성화되었습니다. 반응하지 않은 아지드-NHS를 제거한 후 단백질-N3는 제한된 양의 상보적 클릭 태그와 반응합니다. 우리의 연구에 따르면 클릭 태그는 24시간 배양 후 단백질-N3과 완전히 반응하므로 추가 정제 단계가 필요하지 않습니다. 따라서 aDoL은 클릭 태그와 단백질의 입력 몰비와 동일합니다. 또한 이 접근 방식은 병렬 마이크로스케일 라벨링을 수행하는 훨씬 더 간단하고 경제적인 방법을 제공합니다. 단백질이 N3-NHS로 사전 활성화되면 두 성분을 혼합하여 보완적인 클릭 태그가 있는 형광단이나 분자를 단백질에 부착할 수 있습니다. 클릭 반응에 사용되는 단백질의 양은 원하는 양일 수 있습니다. 한 예에서 우리는 총 0.5 mg의 항체를 사용하여 9개의 서로 다른 형광단과 병행하여 항체를 표지했습니다. 또 다른 예에서 우리는 2에서 8까지의 표적 aDoL 값으로 Ab에 라벨을 붙였습니다. 안정성 비교 연구에서 제안된 클릭 프로토콜을 사용하여 접합된 형광단이 표준 NHS-형광단 라벨링보다 오랫동안 단백질에 부착된 상태로 유지되는 것을 발견했습니다.

단백질은 생물학에서 중심적인 역할을 하며 단백질을 눈에 보이거나 감지할 수 있게 만드는 것은 연구자가 단백질의 기능과 상호 작용을 연구하는 데 필수적입니다. 2001년에 Sharpless는 "클릭"을 통해 두 분자를 결합하는 간단한 전략을 설명하는 획기적인 논문을 발표했습니다. 나중에 Meldal과 Bertozzi는 화학을 더욱 발전시켜 광범위한 응용이 가능하도록 만들었습니다2,3. 20년 후 그들의 업적은 인정을 받아 노벨 화학상을 수상했습니다. 생체직교 화학 또는 클릭 화학은 복잡한 시스템4,5,6,7,8,9,10에서 프로브 또는 태그를 사용하여 높은 특이성, 변형된 개별 단백질을 타겟팅하는 데 큰 이점을 보여주었습니다. 또한 천연 단백질11,12에 부착된 단일 태그를 달성하기 위한 화학 및 위치 선택적 라벨링 방법의 다른 중요한 발전도 있었습니다. 포괄적인 리뷰와 단백질 생체접합에 관한 서적을 보려면13,14,15를 참조하세요. 시스테인 잔기가 부위별 단백질 접합을 위한 또 다른 인기 있는 표적이라는 점도 언급할 가치가 있습니다. 대부분의 단백질은 표적화할 수 있는 천연 유리 티올을 포함하지 않으며 이황화 결합의 감소는 구조에 해로운 영향을 미칠 수 있으므로 점 돌연변이를 통해 단일 시스테인 잔기를 도입하는 것이 정확한 단백질 위치에 단일 태그를 부착하는 데 선호되는 접근 방식입니다. . 위에서 언급한 접근법에 관계없이, 전통적인 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르 및 기타 활성 에스테르는 형광단, 발색단, 비오틴 및 DNA를 라이신 잔기를 통해 단백질에 부착하는 데 선호되는 작용기로 남아 있습니다. 대부분의 단백질에는 라이신 잔기가 풍부하여 라벨링이 용이하며, 이는 1단계 반응에 1단계 정제를 더한 과정입니다. 그럼에도 불구하고 활성 에스테르의 불안정성(가수분해), 반응 효율의 불일치, 단백질 기능에 영향을 미치는 과도한 라벨링에 대한 우려로 인해 여전히 어려운 작업으로 남아 있습니다.

여기서는 쉽게 사용할 수 있는 구리가 없는 클릭 화학 시약을 사용하여 표적 aDoL을 보장하는 라벨링 방법을 설명합니다. 부착 부위는 확률적으로 단백질 표면의 라이신 잔기에 표적화되며, aDoL은 각 단백질에 접합된 태그(형광단)의 평균 수입니다. 이는 중간에 하나의 정제 단계가 있는 2단계 반응입니다(그림 1 참조). 첫 번째 단계로 N3-NHS로 단백질을 활성화시키고 반응 후 과잉의 N3-NHS를 제거하였다. 두 번째 단계에서는 단백질-N3를 원하는 aDoL과 동일한 몰 비율로 형광단-DBCO와 혼합했습니다. 24시간 배양 후 표지된 단백질을 사용할 수 있습니다.