모놀리스 사용

Jun 14, 2023

그림 1:CIMac PrimaS 모노리스 크로마토그래피 컬럼을 사용한 IVT 반응 분석의 크로마토그램.

시험관내 전사(IVT)는 메신저 RNA(mRNA) 생산에서 중요한 단계입니다. 2022년 3월 웹 세미나에서 Rok Sekirnik(Sartorius의 일부인 BIA Separations의 mRNA 및 플라스미드 DNA(pDNA) 응용 공정 개발 책임자)는 IVT 중에 사용되는 시약 농도를 최적화하면 생성되는 mRNA의 양을 최대화하는 데 도움이 된다고 설명했습니다. 약물 개발자에게는 IVT를 실시간으로 측정할 수 있는 분석 방법이 절실히 필요합니다. Sekirnik은 CIMac PrimaS 모노리스 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 뉴클레오시드 삼인산(NTP), 캡핑 시약 및 플라스미드의 농도 모니터링을 포함하여 IVT의 라인 분석을 어떻게 가능하게 하는지 보여주었습니다.

프레젠테이션 Sekirnik은 SARS-CoV-2에 대한 mRNA 백신에 포함된 것과 같은 4,000개 뉴클레오티드 mRNA 분자가 ~1.3 MDa이며 이는 표준 IgG 항체보다 약 10배 더 크다는 점에 주목했습니다. 메신저 RNA는 또한 음전하를 띠고 높은 염 농도에 노출되면 소수성이 됩니다. 단백질 번역이 가능하려면 5' 캡과 폴리아데닐화(폴리-A) 꼬리가 있어야 합니다. 폴리-A 꼬리는 전사에 사용되는 DNA 주형으로 인코딩되거나 IVT 후에 효소적으로 추가될 수 있습니다. 마찬가지로, IVT 도중이나 이후에 5' 캡을 추가할 수 있습니다.

이러한 특성을 고려하여 의약품 개발자에게는 실시간으로 mRNA 수율과 캡핑 효율을 측정할 수 있는 분석 방법이 필요합니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 이러한 평가에 도움이 되지만 분석가는 적합한 결합 화학, mRNA에 대해 충분히 큰 표면적 및 신속한 분석 기능을 제공하는 분리 매체를 선택해야 합니다. 다공성 입자를 포함하는 비드 기반 매체에서는 확산으로 인해 질량 전달이 제한되어 분석 시간이 길어지고 현장 평가 가능성이 제한됩니다. 비드는 또한 역류 흐름을 생성하여 회복을 감소시키는 전단 응력을 생성합니다.

CIMac PrimaS 모노리스 컬럼은 폴리메타크릴레이트 고정상을 통한 대류 물질 이동에 의존합니다. 분리는 음이온 교환과 수소 결합 다중 모드 상호 작용을 기반으로 합니다. 기둥을 통과하는 층류는 전단 응력을 최소화합니다. 다공성 입자와 비교하여 마이크로채널은 mRNA 결합을 위해 훨씬 더 많은 표면적을 제공합니다. 채널에는 막다른 기공이 없기 때문에 결합 용량과 분해능은 유속 전반에 걸쳐 동일하게 유지됩니다.

이 기능을 통해 분석가는 분해능을 저하시키지 않고 실시간으로 IVT를 평가할 수 있을 만큼 신속하게 샘플을 처리할 수 있습니다. Sekirnik은 하나의 분석법으로 mRNA, pDNA, 캡핑 시약 및 개별 NTP를 분리하고 정량화할 수 있다고 지적했습니다(그림 1). 결과는 3분 이내에 생성됩니다.

이러한 기능을 통해 5' 캡핑 효율성을 포함한 mRNA 생산 동역학을 모니터링하고 제어할 수 있습니다. Sekirnik은 캡이 없는 mRNA를 선택적으로 분해하는 엑소뉴클레아제를 사용하는 경우 샘플의 mRNA 농도를 분석하고 효소 처리한 후 다시 분석하여 소화되지 않은 분자를 정량화할 수 있다고 설명했습니다. 처리 전후의 농도 값을 비교하면 IVT 반응의 캡핑 효율이 드러납니다. 분석가는 그에 따라 공급 요법과 시약 농도를 조정하여 mRNA 캡핑 및 수율을 최적화할 수 있습니다.

Sekirnik은 유가식 IVT 프로세스의 데이터를 사용하여 이러한 가능성을 입증했습니다. Sartorius는 구아노신 삼인산(GTP)과 역전 방지 캡 유사체(ARCA)의 1:4 비율로 IVT를 시작했습니다. 공정 시작 1시간 후 캡핑 효율은 높았지만(80%) 수율은 낮았습니다. 그런 다음 팀은 GTP:ARCA 비율을 유지하면서 반응 전반에 걸쳐 NTP 수준을 조정하는 공급 전략을 사용했습니다. 이러한 변화로 인해 캡핑 효율성(80%)이나 제품 품질이 저하되지 않으면서 수율이 6배(최대 11.7mg/mL) 증가했습니다.

분석가는 이러한 워크플로우를 사용하여 상한 효율성과 수율에 대한 정보를 신속하게 얻을 수 있습니다. Sartorius PATfix 소프트웨어에는 프로세스 모니터링을 용이하게 하는 사전 로드된 분석 시퀀스 및 도구가 포함되어 있습니다. 또한 이 회사는 mRNA 제조 및 공정 분석을 위한 여러 도구를 제공하기 위해 다른 결합 화학이 포함된 모놀리스 컬럼을 제공합니다.